免疫荧光双染

下面是小编为大家整理的免疫荧光双染,供大家参考。

　免疫荧光双染

　 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。

　服务说明 冰冻切片 荧光 tunel+ + 免疫荧光双标 试验步骤

　1、 冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定 10min，待丙酮完全干后于 PBS（ PH7.4）

　中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。

　2、 修复：切片稍甩干后用组化笔在组织四周画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶 K 工作液（蛋白酶 K 储存液用 PBS 1:9 稀释）

　掩盖组织，37 度温箱 孵育 30min。将玻片置于 PBS（ PH7.4）

　中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。

　3、 破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液掩盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于 PBS （ PH7.4）

　中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。

　4、 加试剂 1,2：按片子数量和组织大小取 tunel 试剂盒内适量试剂1

　(TdT)

　和试剂 2( dUTP) 按 2:29 混合（试剂 1,2 为现配现用）

　，加到圈内掩

　盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育 2 小时 ，湿盒内加少量水保持湿度。

　5、 BSA 封闭: 将玻片置于 PBS（ PH7.4）

　中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min ，在圈内滴加用 3 %BSA 匀称掩盖组织，室温封闭 30min。

　6、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加 PBS 按肯定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4°C 孵育过夜。

　（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

　7、 加二抗：玻片置于 PBS（ PH7.4）

　中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的 二抗掩盖组织，避光室温孵育 50min。

　8、 DAPI 复染细胞核：

　切片用 PBS（ PH7.4）

　洗涤 3 次，每次 5min。

　去除 PBS后在圈内滴加 DAPI 染液，避光室温孵育 10min。

　9 9、 、封片：玻片置于 PBS（PH7.4 ）

　中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

　10、 、

　镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观看并采集图像。（紫外激发波长 330-380nm ，放射波长 420nm ； FITC 绿光激发波长 465-495nm ，放射波长 515-555 nm ； CY3 红光激发波长 510-560 ，放射波长 590nm ）

　 石蜡切片 荧光 tunel+ + 免疫荧光双标试验步骤

　 1、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min- 二甲苯Ⅱ15-20min- 无水乙醇 Ⅰ10min- 无水乙醇 Ⅱ10min-95% 酒精 5min-90%酒精5min-80%酒精 5min-70%酒精 5min-蒸馏水洗 （冬天脱蜡时间略微延长）。

　2、 修复：切片稍甩干后用组化笔在组织四周画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶 K 工作液（蛋白酶 K 储存液用 PBS 1:9 稀释）

　掩盖组织，

　37 度温箱 孵育 30min。将玻片置于 PBS（ PH7.4）

　中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。

　3、 破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液掩盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于 PBS （ PH7.4）

　中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。

　4、 加试剂 1,2：按片子数量和组织大小取 tunel 试剂盒内适量试剂1

　(TdT)

　和试剂 2( dUTP) 按 2:29 混合，加到圈内掩盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育 2 小时 ，湿盒内加少量水保持湿度。

　5、 BSA 封闭: 将玻片置于 PBS（ PH7.4）

　中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min ，在圈内滴加用 3 %BSA 匀称掩盖组织，室温封闭 30min。

　6、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加 PBS 按肯定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4°C 孵育过夜。

　（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

　7、 加二抗：玻片置于 PBS（ PH7.4）

　中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的 二抗掩盖组织，避光室温孵育 50min。

　8、 DAPI 复染细胞核：

　切片用 PBS（PH7.4 ）

　洗涤 3 次，每次 5min 。

　去除PBS 后在圈内滴加 DAPI 染液，避光室温孵育 10min 。

　9 9、 、封片：玻片置于 PBS（PH7.4 ）

　中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

　10、 、

　镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观看并采集图像。（紫外激发波长 330-380nm ，放射波长 420nm ； FITC 绿光激发波长 465-495nm ，放射波长 515-555 nm ； CY3 红光激发波长 510-560 ，放射波长 590nm ）

　留意事项 1、荧光染色后一般在 1h 内完成观看，或于 4℃保存 4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

　2、每次试验均需设置以下三种对比：

　(1) 阳性对比：阳性血清+荧光标记物;

　(2) 阴性对比：阴性血清+荧光标记物;

　(3) 荧光标记物对比：PBS+荧光标记物。

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